Ratna Asmah Susidarti, dkk

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA BIOAKTIF EKSTRAK AKAR BAMBU ORI (Bambusa arundinacea Retz.Willd.) DAN AKAR BAMBU KUNING (Bambusa vulgaris Schrad. Ex Wendl.)

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF BIOACTIVE COMPOUND(S) FROM ROOT EXTRACTS OF SPINY BAMBOO (Bambusa arundinacea Retz.Willd.) AND YELLOW BAMBOO (Bambusa vulgaris Schrad. Ex Wendl.)

Ratna Asmah Susidarti 1), Harliantoro2), C.J. Soegihardjo 1)
1) Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada,
2) Dinas Kesehatan Kabupaten Kulon Progo

Download file: 26Bambusa_Ratna Revisi  

ABSTRAK

Kanker menempati urutan kedua sebagai penyakit yang mematikan setelah penyakit jantung. Besarnya potensi tanaman sebagai sumber senyawa obat telah memotovasi peneliti untuk melakukan eksplorasi dalam usaha pencarian obat kanker. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan bioaktivitas ekstrak akar dari Bambusa arundinacea Retz. Willd. dan Bambusa vulgaris Schrad. Ex Wendl. serta mengisolasi  dan mengidentifikasi senyawa bioaktif dalam ekstrak yang paling aktif dengan metode bioassay guided  fractionation menggunakan Brine Shrimp Lethality Test (BST) sebagai selektor penapisan. Serbuk kering  akar (300 g) dimaserasi berturut-turut dengan wash benzene, etanol 80 % dan infundasi. Hasil uji  menunjukkan bahwa ekstrak etanolik B. vulgaris (10 μg/ml) merupakan ekstrak yang paling aktif dengan  menyebabkan kematian larva udang sebesar 84 %. Ekstrak ini kemudian dipartisi berturut-turut  menggunakan kloroform dan etil asetat. Fraksi kloroform (10 μg/ml) menyebabkan kematian udang sebesar  82%. Pemisahan fraksi kloroform menggunakan kromatografi cair hampa menghasilkan 6 fraksi gabungan.  Pemisahan Fraksi IV dengan KLT preparatif menghasilkan 40 mg kristal putih dengan titik lebur 111-120  ºC dan LC50 terhadap larva udang sebesar 11,95 μg/ml. Pada analisis Kromatografi Gas-Spektrometri  Massa isolat menghasilkan 3 puncak. Puncak dengan waktu retensi 9,800 dan puncak ion molekuler pada  m/z 414 diidentifikasi sebagai stigmast-5-en-3-ol atau ß-sitosterol berdasarkan perbandingan dengan data spektra massa referensi (NIST12.LIB; NIST62.LIB dan WILEY229.LIB).

Kata kunci : Bambusa arundinacea, Bambusa vulgaris, BST, ß-sitosterol.

ABSTRACT

Cancer is a second dagerous disease after heart attack. The potention of plants as a source of drugs has been  motivated researcher to explore the active constituents in order to discover new anticancer agents. The  objectives of the research were to evaluate the bioactivity of root extracts of Bambusa arundinacea Retz.  Willd. and Bambusa. vulgaris Schrad. Ex Wendl. and to isolate the bioactive compound(s) from the most  active extract using bioassay (BST) guided fractionation method. The ground dried root (300 g) was  successively macerated with wash benzene, ethanol 80 %, and the residu was infundated. The ethanolic  extract of B. vulgaris was the most active extract against brine shrimp (10 μg/ml; 84 % lethality). This  extract was then partitioned with chloroform and ethyl acetate. The chloroform (10 μg/ml) cause brine  shrimp lethality of 82%. Separation of the chloroform fraction using vaccum liquid chromatography gave 6  combined fractions. Separation of fraction IV with preparative TLC gave 40 mg white crystals (m.p. 111 –  120°C). The isolate was significantly toxic to brine shrimp with the LC50 of 11,95 μg/ml. The GC-MS  analysis of the isolate showed that it consists of three compounds. The compounds with retention time of  9,800 (molecular ion peak at m/z 414) was identified as stigmast-5-en-3-ol or ß-sitosterol based on  comparation with reference value (NIST12.LIB; NIST62.LIB and WILEY229.LIB).

Key words : Bambusa arundinacea, Bambusa vulgaris, BST, ß-sitosterol.

PENDAHULUAN

Salah satu penyakit yang semakin meningkat angka kejadiannya dan dikenal  banyak macam serta penyebabnya adalah  kanker. Kurang lebih 120 jenis kanker sudah  diketahui dan dikelompokkan dalam 12 bagian  besar berdasarkan organ atau jaringan tubuh  yang diserang (Saputra dkk., 2000). Walaupun  kini banyak ditemukan obat-obat kemoterapi  yang menunjang keberhasilan pengobatan  kanker, namun hasilnya dinilai masih belum  memuaskan karena adanya efek samping yang  cukup besar. Selain itu, ditemukan juga  adanya penurunan kepekaan sel-sel kanker  terhadap obat-obat kemoterapi konvensional  baik secara cepat atau lambat (Awal dkk.,  2004). Hal tersebut telah mendorong  dilakukannya penelitian untuk menemukan  obat antikanker baru dengan aktivitas yang  lebih poten dan selektif serta efek samping  yang rendah. Salah satu alternatif dalam  menemukan obat baru adalah melalui  penapisan senyawa bioaktif yang terkandung dalam tanaman obat.

Bambu ori (Bambusa arundinacea  Retz.Willd.) dan bambu kuning (Bambusa  vulgaris Schrad. Ex Wendl.) telah dikenal  secara luas sebagai tanaman obat. Bambu ori  secara tradisional digunakan untuk mengobati  tuberkulosis (Dharmananda, 2005; Schuster,  2005) serta kurap (Anonim, 2006). Muniappan  dan Sundararaj (2003) melaporkan bahwa  bambu ori mempunyai aktivitas sebagai  antiinflamasi dan menghambat proliferasi sel  karsinoma ascite Ehrlich lebih kuat dibanding  Catharanthus roseus yang selama ini dikenal  sebagai tanaman obat anti-kanker (Rana dkk.,  2004). Akar bambu ori juga digunakan sebagai  obat tradisional untuk sirosis dan tumor,  terutama tumor abdomen, hati, limpa, dan  perut (Anonim, 2006). Tanaman ini juga  digunakan secara tradisional untuk mengobati sifilis dan gonorrhea (Igoli dkk., 2005).

Penelitian ini bertujuan untuk  membandingkan bioaktivitas ekstrak akar B.  arundinacea Retz. Willd. dan B. vulgaris  Schrad. Ex Wendl., serta mengisolasi dan  mengidentifikasi senyawa bioaktif dalam  ekstrak yang paling aktif dengan metode  bioassay guided fractionation menggunakan  Brine Shrimp Lethality Test (BST) sebagai selektor penapisan.

METODOLOGI PENELITIAN

Bahan

Akar tanaman Bambusa arundinacea  Retz. Willd. dan Bambusa vulgaris Schrad. Ex  Wendl. diambil dari tanaman yang tumbuh di  wilayah Kecamatan Pajangan, Kabupaten  Bantul, D.I. Yogyakarta antara bulan April  sampai Oktober 2005. Akar dicuci,  dikeringkan dengan oven pada suhu 55°C,  dipotong-potong kecil lalu digiling dengan mesin sehingga diperoleh serbuk akar.

Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi  adalah n-heksana, etilasetat, metanol, dan  kloroform berkualitas teknis (Brataco). Pelarut  yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis  preparatif adalah n-heksana dan etilasetat pro  analisis (E. Merck). Bahan untuk kromatografi  cair hampa terdiri atas silika gel 60 PF254 kode  1.007749.1000 (E. Merck). Untuk KLT  preparatif digunakan silika gel 60 F254 kode  1.05554.001 (E. Merck) dan pereaksi semprot  Ce (IV) sulfat. Bahan untuk uji BST adalah  kista Artemia salina (Golden West, USA), air laut, dan ragi instan (Fermipan).

Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian  ini adalah rotary evaporator hampa (Heidolph  VV 2000), Kromatografi Gas–Spektrometer  Massa (Hewlett Packard 5890 Series II),  bejana kromatografi (Camag) dab alat-alat  untuk uji BST terdiri atas wadah penetasan  telur, lampu pijar, vorteks, aerator, pipet, dan flakon 10 ml.

Jalannya Penelitian

a. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di  Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada.

b. Ekstraksi

Serbuk kering akar (300 g) B.  arundinacea dan B. vulgaris dimaserasi  berturut-turut dengan wash benzene dan etanol  80 % sebanyak 3 kali untuk tiap pelarut.  Pelarut diuapkan dengan rotary evaporator  hampa, sehingga didapat ekstrak wash  benzene dan etanol. Ampas serbuk dari  penyarian terakhir diangin-anginkan sampai  kering, kemudian dilakukan infundasi. Infus  kemudian dikeringkan, sehingga diperoleh ekstrak air.

c. Uji hayati dengan BST

Masing-masing ekstrak diuji dengan  metode BST untuk menentukan ekstrak yang  aktif dan layak untuk difraksinasi lebih lanjut.  Ekstrak dianggap aktif bila harga LC50 kurang dari 1000 μg/ml.

1. Penyiapan larva uji.

Kista atau telur Artemia salina direndam  dalam aquades (± 1 jam), ditiriskan, kemudian  ditetaskan dalam tangki kecil berisi 500 ml air  laut yang telah terbagi menjadi 2 bilik dengan  sekat berlubang-lubang dengan diameter 2  mm. Bilik penetasan diberi kondisi gelap  sedangkan bilik satunya diberi sumber cahaya  (lampu pijar), lalu aerator dihidupkan. Telur  akan menetas dalam 24 jam dan larva  berenang menuju bilik terang karena larva  bersifat fototropik. Setelah berumur 48 jam larva Artemia siap digunakan.

2. Penyiapan sampel uji.

Duaratus limapuluh mg sampel yang  sudah ditimbang secara seksama dilarutkan  dalam 500 μl DMSO (dimetilsulfoksida) dan  disebut larutan A (500 μg sampel/μl DMSO).  Limapuluh mikroliter larutan A diencerkan  dalam 450 μl DMSO dan disebut larutan B (50  μg sampel/μl DMSO). Limapuluh mikroliter  larutan B diencerkan dengan cara yang sama  dan diperoleh larutan C (5 μg sampel/μl  DMSO). Gelas-gelas flakon yang sudah ditera  5 ml masing-masing diisi dengan 10 μl larutan  A, B atau C lalu ditambahkan air laut hingga  volume akhir 5 ml. Konsentrasi akhir sampel  dalam masing-masing flakon adalah 1000, 100, dan 10 μg /ml.

3. Uji toksisitas.

Sepuluh larva Artemia yang sehat dan  aktif bergerak dimasukkan dalam tiap flakon.  Setetes suspensi fermipan 3 mg dalam 5 ml air  laut ditambahkan pada tiap flakon sebagai  makanan larva. Flakon diisi air laut hingga  volume akhir 5 ml. Setelah 24 jam jumlah larva yang masih hidup dalam masing-masing  flakon dihitung dan dicatat kemudian  ditentukan % kematian larva. Sebagai kontrol  negatif digunakan pelarut saja. Data-data  dianalisis dengan analisis probit untuk menentukan LC50.

4. Fraksinasi dengan partisi

Sebanyak 33 g ekstrak paling aktif  dilarutkan dalam 150 ml air hangat. Ekstrak  larut air dipisahkan dan dipartisi dengan  kloroform dan etilasetat menggunakan corong  pisah. Fraksi kloroform dan fraksi etilasetat  hasil partisi diuapkan hingga kering. Masingmasing  fraksi diuji aktivitasnya dengan  metode BST dan dilakukan KLT. Fraksi yang paling aktif dilakukan fraksinasi lebih lanjut.

5. Fraksinasi dengan kolom kromatografi cair hampa

Pemisahan kandungan kimia fraksi  paling aktif dari hasil partisi dilakukan dengan  kromatografi cair hampa yang dielusi berturutturut  dengan n-heksana 100 %; campuran nheksana  – etilasetat (v/v) dengan nisbah 20:1 ;  15:1 ; 10:1 ; 5:1 ; 3:1, dan 1:1; kemudian  etilasetat 100 %, dan terakhir metanolkloroform  (1:1) dengan volume masingmasing  adalah 100 ml. Terhadap masingmasing  fraksi dilakukan uji KLT dan  bercaknya dideteksi menggunakan pereaksi  semprot Ce (IV) sulfat untuk mengetahui  profil metabolitnya. Fraksi-fraksi dengan  profil metabolit yang mirip disatukan. Fraksi  gabungan tersebut diuji aktivitasnya dengan  metode BST dan fraksi yang aktif dipisahkan  dengan KLT preparatif untuk diisolasi senyawa aktifnya.

6.Isolasi senyawa aktif dengan KLT Preparatif

Fraksi aktif dari hasil fraksinasi  kromatografi cair hampa dilarutkan dalam  metanol – kloroform (1:1), kemudian  ditotolkan berupa pita pada lempeng KLT  preparatif dengan fase diam silika gel 60 F254  dan dielusi 3 kali dengan fase gerak n-heksana  – etilasetat (2:1). Deteksi dilakukan di bawah  sinar UV 254 dan 366 nm dan menyemprot  salah satu tepi lempeng dengan pereaksi Ce  (IV) sulfat sementara bagian lempeng yang  lain ditutup. Bagian yang disemprot Ce (IV)  sulfat dipanaskan dengan hair dryer sehingga  pita-pita bercak nampak. Pita yang  dikehendaki dikerok dengan spatula. Serbuk  hasil pengerokan diekstraksi dengan metanol –  kloroform (1:1). Isolat-isolat yang didapat  diuji aktivitasnya dengan BST dan diuji  kemurniannya dengan KLT dan kromatografi gas.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Maserasi 300 g serbuk akar B.  arundinacea dan atau B. vulgaris dengan wash  benzene menghasilkan ekstrak berminyak  berwarna oranye dengan berat masing-masing  1,53 dan 0,40 g, sedang maserasi dengan  etanol 80 % menghasilkan ekstrak kental  berwarna coklat tua dengan berat 7,67 dan  4,67 g. Lima puluh gram ampas penyarian  kedua tanaman tersebut dilakukan infundasi  dan diperoleh ekstrak air dengan berat masingmasing  1,12 dan 1,4 g. Hasil uji BST dari  masing-masing ekstrak disajikan dalam Tabel  I. Ekstrak etanolik akar B. vulgaris merupakan  ekstrak yang paling aktif, yang mana pada  konsentrasi 1000, 100 dan 10 μg/ml  menyebabkan kematian larva udang berturutturut sebesar 96, 90 dan 84%.

Partisi terhadap ekstrak etanolik akar B.  vulgaris dilakukan untuk memisahkan  senyawa-senyawa yang relatif non polar  dengan yang polar serta untuk mendapatkan  fraksi-fraksi dengan kandungan kimia yang  lebih sederhana. Dari hasil partisi 33 g ekstrak  etanolik akar B. vulgaris diperoleh 2,55 g  fraksi kloroform, 3,66 g fraksi etilasetat dan  23,94 g fraksi air. Hasil uji toksisitas dengan  metode BST terhadap fraksi-fraksi tersebut  disajikan dalam Tabel II. Dari tabel tersebut  dapat dilihat bahwa fraksi kloroform  merupakan fraksi yang paling aktif, yang  mana pada konsentrasi 1000 μg/ml  menyebabkan kematian larva udang sebesar 98 %.

Pemisahan fraksi kloroform dengan  kromatografi cair hampa menggunakan kolom  silika gel 60 PF254 (E. Merck) dengan fase  gerak n-heksana dan campuran n-heksana–  etilasetat berbagai perbandingan diperoleh 9  fraksi. Masing-masing fraksi diperiksa profil  kandungan senyawanya secara TLC menggunakan silika gel 60 F254 dan fase  gerak  n-heksana-etilasetat (4:1). Deteksi  kromatogram dilakukan dengan penampak  bercak Ce (IV) sulfat. Fraksi 6-9  memperlihatkan profil kromatogram yang  sama(Gambar 1), sehingga dapat disatukan.  Dengan demikian, dari kromatografi cair  hampa terhadap fraksi kloroform diperoleh 6  fraksi. Hasil uji BST menunjukkan bahwa  pada konsentrasi 100 (μg/ml) keenam fraksi  (I-VI) tersebut tersebut menyebabkan  kematian larva udang berturut-turut sebesar 22, 68, 74, 90, 32 dan 96%.

Dari kromatogram dapat dilihat bahwa  fraksi III dan IV mengandung senyawa utama.  Karena fraksi IV lebih aktif dan mempunyai  komponen senyawa lebih sedikit dari pada  fraksi III, maka terhadap fraksi tersebut  dilakukan KLT preparatif untuk diisolasi  senyawa utamanya. Dari 130 mg fraksi IV  diperoleh 40 mg isolat senyawa utama berupa kristal putih dengan titik lebur 111 – 120°C.

Masih lebarnya jarak lebur  menunjukkan bahwa isolat tersebut belum  murni. Hal ini ditegaskan dengan  kromatogram GC (Gambar 2) yang  memperlihatkan 3 puncak dengan waktu  retensi 9,125; 9,342 dan 9,800 menit. Isolat  senyawa utama toksik terhadap larva udang  dengan harga LC50 sebesar 11,95 μg/ml. Isolat  bereaksi positif dengan pereaksi Liebermann-  Burchard dan FeCl3. Hal ini memberikan  informasi adanya senyawa golongan triterpen atau steroid dan senyawa fenolik.

Senyawa dengan waktu retensi 9,125  dan 9,342 menit yang mempunyai puncak ion  molekuler (M . ) berturut-turut pada m/z 516  dan 413 belum teridentifikasi. Puncak dengan  waktu retensi 9,800 dan puncak ion molekuler pada m/z 414 (Gambar 3) diidentifikasi  sebagai stigmast-5-en-3-ol atau ß-sitosterol  (Gambar 4) berdasarkan perbandingan dengan  data spektra massa referensi (NIST12.LIB;  NIST62.LIB dan WILEY229.LIB).  Fragmentasi yang khas dari ß-sitosterol adalah  adanya puncak ion fragmen pada m/z 273  yang timbul karena hilangnya rantai samping  oleh pemutusan pada ikatan antara C17 – C20.  Hilangnya air dari ion fragmen ini  menghasilkan puncak ion fragmen pada m/z  255. Lepasnya air dari ion molekul ditandai  dengan munculnya puncak pada m/z 396 (Susidarti, 2003).

Gambar 1. Profil kromatogram lapis tipi fraksi-fraksi hasil pemisahan dengan kromatografi cair hampa fraksi kloroform akar Bambusa vulgaris. Fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak n-heksana-etilasetat (4:1).

Gambar 2. Profil kromatogram gas isolat senyawa utama. Jenis kolom : HPS, gas pembawa : helium, tekanan gas 12 kPa dan aliran gas 30 ml/menit, suhu injektor 280 °C, suhu awal kolom 240 °C, kenaikan temperatur 10 °C per menit sampai 300 °C, panjang kolom 30 meter, diameter kolom 0,25 mm

Gambar 3. Spektrogram massa dari komponen senyawa utama dengan waktu retensi 9,800

Gambar 4. Struktur stigmast-5-en-3-ol atau ß-sitosterol

KESIMPULAN

Ekstrak etanolik akar Bambusa vulgaris  mengandung isolat aktif yang terdiri dari 3  senyawa. Isolat tersebut toksik terhadap larva  Artemia salina dengan nilai LC50 = 11,95  μg/ml. Salah satu senyawa dalam campuran tersebut adalah stigmast-5-en-3-ol atau ßsitosterol.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2006. Dr. Duke’s Phytochemical and  Ethnobotanical Databases. http:  //www.hort.purdue.edu., diakses Maret 2006.

Awal, M.A., Nahar, A., Hossain, M.S., Bari, M.A.,  Rahman, M., dan Haque, M.E. 2004.  Brine shrimp toxicity of leaf and seed  extracts of Cassia alata Linn. and their  antibacterial potency; J. Med. Sci. 4 (3):188-193.

Dharmananda, S., 2005. Bamboo as medicine;  Institute for Traditional Medicine,  Portland, Oregon.  http://www.itmonline.org/arts/bamboo.ht m., diakses Desember 2006.

Igoli, J.O., Ogaji, O.G., Tor-Anyiin, T.A., dan  Igoli, N.P., 2005. Traditional medicine  practice amongst the Igede people of  Nigeria. Part II. Afr. J. Trad. CAM 2 (2):134 – 152.

Muniappan, M. dan Sundararaj, T., 2003.  Antiinflammatory and antiulcer activities  of Bambusa arundinacea . J. Ethnopharmacol. 2 (3):161-167.

Rana, M., Khanam, J.A. dan Asad-Ud-Daula, M.,  2004. Antineoplastic screening of some  medicinal plants against Ehrlich ascites  carcinoma in mice, J. Med. Sci., 4 (2):142-145.

Saputra, K., Maat, S. dan Soedoko, R., 2000.  Terapi Biologi untuk Kanker. Airlangga Press, Surabaya, 10.

Schuster, B. 2005. Bamboo-Homeopathic proving  of Bambusa arundinacea, Repertory and  cases.  http://www.minimum.com/b.asp?a=bamb oo_schuster., diakses Maret 2006.

Susidarti, R.A. 2003. Chemical constituents and  biological activities of Micromelum  minutum (Rutaceae) and two Eugenia  species (Myrtaceae), Thesis , University Putra Malaysia, 125-139.

Alamat korespondensi:   Bagian Kimia Farmasi  Fakultas Farmasi UGM  Sekip Utara, Yogyakarta E-mail : susidarti@yahoo.com

p style=”text-align:justify;”

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s


%d bloggers like this: